Extracción de los artrópodos fósiles del Eoceno Inferior del ámbar de Cambay.

Introducción

El ámbar conserva una gran variedad de organismos de diferentes hábitats en y cerca de los bosques productores de ámbar. El análisis detallado y una comparación de las inclusiones del ámbar revela la historia evolutiva de estos organismos, y es especialmente importante en los casos en los que el registro fósil es pobre o previamente desconocido. Además, mediante el estudio de los fósiles de los depósitos privados (de particulares), la composición, diversidad y ecología de los antiguos ecosistemas terrestres pueden ser descubiertos. El ámbar indio de Cambay fue depositado hace unos 50-52 millón años durante el Eoceno temprano, al mismo tiempo que la colisión del subcontinente indio con Asia. Los depósitos de ámbar están situados en las pizarras de Cambay de Gujarat (zona occidental) ( Rust et al. 2010 ). La resina fósil de las minas de lignito Vastan y Tadkeshwar han conservado una gran diversidad de flora y fauna, incluyendo 22 órdenes y más de 60 familias de artrópodos hasta ahora ( Rust et al 2010. ; Paul C. Nascimbene, comunicación personal con el escritor de este articulo 2012).

Todas las resinas de árboles naturales, ya sea fósil o existente, se clasifican gracias a sus características químicas estructurales ( Anderson et al. 1992 ). La química del ámbar de Cambay, así como la micro anatomía de su madera fósil asociada y la reciente recuperación de polen fósil, nos indican que los árboles de la familia de los angiospermas Dipterocarpaceae eran la fuente de esta resina fósil. 

Dipterocarpae produce una resina de Clase II, también conocida como  resina de tipo “dammar" ( Dutta et al. 2009 ). En contraste con la clase de resina más típica (clase I) de gimnospermas, las  resinas de Clase II tienen una composición química base de tipo sesquiterpenoide bicadenal ( Mallick et al. 2009 ) y en consecuencia se disuelven en disolventes orgánicos ( van Aarssen et al. 1990 ). 

Los terpenoides son derivados estructurales del isopreno. Mientras que los terpenos sólo contienen hidrocarburos, los terpenoides también contienen grupos funcionales. Las resinas más jóvenes tienen un alto porcentaje de sustancias volátiles y aromáticas. Con el tiempo estas sustancias se volatilizan y la resina se polimeriza. El proceso de polimerización se ve reforzada por las reacciones de oxidación, reticulación y ciclación, que conduce al endurecimiento de la resina ( Poinar 1992 ).

A pesar de su temprana edad (Eoceno Inferior, el ámbar de clase II de Cambay  está  débilmente polimerizado y reticulado. Durante el proceso de trabajo en el laboratorio, las superficies recién pulidas se vuelven pegajosas y se suavizan considerablemente. La mayor parte del ámbar en bruto es de color rojo oscuro o rojizo a casi negro e incluso las piezas más transparentes a menudo contienen zonas oscuras y las impurezas dificultan el examen óptico de las inclusiones fósiles.

En este estudio, se examinaron varios grupos de disolventes químicos para determinar su capacidad de disolver trozos del ámbar de Cambay. Dado que este ámbar de Clase II esta  mucho menos polimerizado que las resinas más prevalentes y bien estudiadas Clase I, es lógico pensar que su solubilidad debería ser parecida a la resina copal, que ya se sabe que se disuelve en diferentes disolventes orgánicos.

Disolver  ámbar proporciona nuevas y prometedoras oportunidades para estudiar las inclusiones en mayor detalle (figuras 1. - 3 ), especialmente con respecto al estudio subcelular y otras micro estructuras. Sin la disolución, los estudios se limitarían a exámenes ópticos tradicionales que, como ya se mencionó anteriormente, a veces son especialmente difíciles en el caso del ámbar de la India por sus oscuros colores. Disolver el ámbar y extraer las inclusiones  proporciona una mejor exanimación de todos los microorganismos asociados, y permite el análisis bioquímico y geoquímico de las inclusiones.

Aparte de la habilidad para disolver el ámbar era importante encontrar un disolvente con bajo riesgo para la salud y que disolviera dicho ámbar de manera rápida y sin destruir o modificar la estructura química de los fósiles incrustados.

Figura. 1. Extracción de una hormiga (STB-314-T'09) del ámbar de Cambay del Eoceno Inferior minas de lignito Tadkeshwar, India A. Hormiga y  planta permanecen en el ámbar indio. B. Espécimen de hormiga aislada después de la disolución de la matriz ambarina con aceite de naranja, piernas desarticuladas. C .Micrografía de barrido electrónico de la hormiga. D. Detalle de las piezas bucales con mandíbulas, galea con muy desarrollado peine galeal, palpus labial, y glossa.

Abreviaturas Institucionales .-STB, Steinmann Institute, de la Universidad de Bonn, Alemania.

Materiales y métodos

Los trozos de ámbar fueron seleccionados al azar, el único criterio fue seleccionar un peso aproximadamente similar para los trozos, siendo este de 0,28 a 0,50 g, con una media de 0,34 g. Las piezas que contenían inclusiones no fueron seleccionadas, ya que el efecto de los disolventes no quedó claro antes de los experimentos. Después del pesaje, las piezas de ámbar se colocaron en tubos de ensayo estériles con tapas con juntas selladoras necesarias para evitar la evaporación de los disolventes volátiles. Los siguientes disolventes fueron evaluados bajo una campana de espuma protectora:

•  La acetona es la cetona más sencilla, y tiene una amplia variedad de posibles aplicaciones, pero se utiliza principalmente como un disolvente aprótico polar.
•  El diclorometano y triclorometano (cloroformo) pertenecen a los hidrocarburos halogenados. Los alcanos halogenados tienen un uso generalizado en el comercio como insecticidas, herbicidas y, por supuesto, como disolventes. Los halogenoalcanos son mejores disolventes que los alcanos correspondientes, debido a su mayor polaridad debido a la carga altamente negativa del halógeno. Ambos productos químicos son tóxicos. El diclorometano es altamente volátil y puede disolver una amplia gama de compuestos orgánicos. Requiere bastante tiempo para su evaporación. El cloroformo (triclorometano) también tiene una amplia gama de aplicaciones, aunque las preocupaciones sobre sus efectos en la salud han conducido a una búsqueda de alternativas. También requiere mucho tiempo para su evaporación.
• La dimetilformamida es un disolvente orgánico aprótico comúnmente utilizado con una tasa de evaporación baja. Se clasifica como una amida, que se deriva del amoníaco. También es perjudicial para los seres humanos.
• El formaldehído (37%), también llamado metanal, es el aldehído más sencillo y el más reactivo de los mismos y bastante perjudicial para los seres humanos.
•  El aceite de naranja se deriva de la cáscara de la fruta de la naranja. Se compone principalmente de d-limoneno, un monoterpeno cíclico. Otros componentes incluyen alcoholes y aldehídos tales como citral B. Por varias razones la composición precisa del aceite de naranja puede variar, debido a su origen natural. En contraste con los hidrocarburos aromáticos de la lista, no hay evidencia de peligro toxico para los seres humanos.
• El éter de petróleo es una mezcla de alcanos con cadenas de diferente longitud. Gracias a la destilación fraccionada, el éter de petróleo está disponible con diferentes puntos de inflamación que van de los 30 hasta los 40 ° C y de 100 a 120 ° C. Aparte del peligro que suponen para el medio ambiente, es perjudicial para los seres humanos. Para los experimentos, se utilizó éter puro de petróleo (benzinum medicinale), así como éter de petróleo con un punto de inflamación de 40 ° C y 60-80 ° C.
• El aceite de trementina es un destilado de resina natural, principalmente de pinos. Este tipo de resina contiene básicamente alfa y beta-pinenos.
•  El tolueno y el xileno son disolventes aromáticos. Pertenecen a los hidrocarburos aromáticos monocíclicos. Generalmente la estructura básica de estos compuestos aromáticos es un anillo de benceno. El tolueno, también conocido como toluol (y, a veces referido como metilbenceno o fenilmetano), es un derivado del benceno monosustituido. El nombre del tolueno se refiere al bálsamo de Tolú, que es un extracto del árbol tropical Myroxylon balsamum ( Fabri et al 1996. ; Soffritti et al 2004. ). A pesar de que el tolueno es mucho menos tóxico que el benceno, es esencial manejarlo con cuidado.
•  El xileno es una mezcla de tres isómeros de doble metilo-sustitución a partir de derivados del benceno.

Figura. 2 Micrografías de barrido electrónico de un ala de dípteros (STB-315-T'09) extraída del ámbar del Eoceno Inferior de Cambay, minas de lignito Tadkeshwar, India. A. Ala aislada casi completa. B. Detalle de la membrana del ala plegada.

Figura. 3 Micrografías de barrido electrónico de una larva Putoidea (STB-316-T'09) del ámbar del Eoceno Inferior de Cambay, minas de lignito Tadkeshwar, India. A .Disposición anular de la ommatidia del ojo con base de la antena. B . Detalle de una cedra sensorial.

Resultados

No todos los disolventes probados fueron capaces de disolver completamente el ámbar de Cambay. La acetona sólo afectó a la superficie exterior del ámbar después de varios días, y, esencialmente solo lo hizo frágil y friable (fácilmente desmenuzable). El éter de petróleo, con sus múltiples puntos de inflamación, hizo que el ámbar se comportara de manera elástica y lo volvió opaco. Además macero las muestras. Después de sólo unos 45 minutos, el ámbar presentaba estrías lineales. Varias horas más tarde, el ámbar inmerso en éter de petróleo se convirtió en una masa arcillosa, mezcla relativamente glutinosa (punto de inflamación de 40 ° C). El éter de petróleo puro produjo los mismos efectos.

Como ya fue mencionado por Rust et al. ( 2010 ), el ámbar de Cambay se disuelve bien en tolueno. El disolvente dio buenos resultados después de una hora, y sólo afectó ligeramente a las inclusiones. Sin embargo, debido a los importantes efectos nocivos para la salud, el tolueno no es el disolvente preferible. Como se describió anteriormente, también se probó el xileno como disolvente aromático. Al igual que el tolueno fue capaz de disolver el ámbar en una hora. Una elección preferible al tolueno, ya que es menos nocivo para los seres humanos. Como ya comento Rust et al. (2010)  era de esperar que el cloroformo funcionara bien como disolvente. Cuando el ámbar se colocó en el líquido, empezó a decolorarse y a disolverse. El ámbar se disolvió en media hora. También probamos el diclorometano debido a que su composición química es similar. Cuando se sumerge en diclorometano, no se observa decoloración del ámbar. El diclorometano tardo alrededor de una hora para disolver el ámbar.

El aceite de naranja disuelve el ámbar de Cambay bastante bien, con un tiempo medio de 3.4 horas. El aceite de trementina también fue capaz de disolver el ámbar, pero tardo mucho más tiempo que cualquier otro disolvente, aproximadamente dos días. La dimetilformamida no fue capaz de disolver el ámbar pasada 1 semana, ni el formaldehído tampoco. El ámbar de Cambay  flotó en estos disolventes. La reacción de disolución de la ámbar a diferentes disolventes se resume en la tabla 1 .

Tabla 1.Reacción química de los diferentes ámbares con los disolventes, su fórmula química, y la duración de la reacción.

Discusión

El ámbar de Cambay se disuelve completamente en varios de los disolventes ensayados, y las características de disolución de las reacciones son similares a las de las resinas dammar jóvenes y las de copal. En 1896, Glimmann y Tschirch ya descubrieron que el cloroformo disuelve muy bien la resina de dammar joven. Descubrieron también que el tolueno no disuelve completamente esta resina joven. Contrariamente el ámbar de Cambay de nuestros experimentos si se disolvió completamente, con la excepción de un pequeño residuo de impurezas. Además, Tschirch y Glimmann (1896) observaron que el éter de petróleo podría disolver resina dammar joven parcialmente, mientras que en nuestro estudio, el ámbar de la India en realidad no se disuelve, pero se suaviza y macera. La discrepancia entre los dos resultados se debe probablemente a las sutiles diferencias químicas entre el ámbar indio y la resina dammar joven.  A pesar de que se sabe que el ámbar de Cambay deriva de Dipterocarpaceae, que actualmente comprende 470 especies asiáticas ( Maury-Lechon y Curtet 1998 ), el árbol dipterocarpae que produce la resina aún no ha sido identificado.

Hemos sido capaces de encontrar dos nuevos disolventes eficaces para disolver el ámbar de la India que no habían sido descritos antes en este contexto. Además, se determinó que el xileno es un disolvente mejor y menos perjudicial para el ámbar de la India que el tolueno. El efecto más potente del xileno en comparación con el del tolueno puede atribuirse a los dos grupos funcionales que liberan electrones en el xileno, los que permiten un efecto mesómero positivo más fuerte. Además, se utilizó una mezcla de los tres isómeros posibles para mejorar los resultados de la disolución. Como era de esperar, el cloroformo disolvió por completo el ámbar. El diclorometano tarda más tiempo que el cloroformo en disolver completamente  las piezas de ámbar. Este resultado no es sorprendente, debido a que el diclorometano está formado por dos grupos funcionales y el cloroformo por tres.

Afortunadamente, hemos sido capaces de demostrar que al menos el aceite de aceite de naranja y la esencia de trementina (ambos disolventes prácticamente no tóxicos) fueron capaces de disolver este ámbar indio en un tiempo razonable. Los componentes no polares de ambos aceites (los terpenos) podrían haber sido capaces de reaccionar con las partes no polares del ámbar. Las composiciones totales de estos terpenos no se han especificado completamente todavía. Son un grupo que contiene diversos hidrocarburos diferentes que operan con más fuerza (debido a sus grupos funcionales) con los componentes del ámbar que lo hacen entre sí.

Una prueba común para diferenciar el ámbar de copal es aplicar acetona a la superficie de piezas de resina fósil. En general, el ámbar no se ve afectado, mientras que el copal si reacciona a la acetona. Sin embargo, este ámbar indio de Cambay también reacciona a la acetona. Las piezas probadas se volvieron quebradizas y se agrietaron. Ragazzi et al. (2003) informaron que el copal se disolvería en etanol. Aunque el etanol no se probó aquí de forma explícita, otros experimentos han demostrado que el ámbar de Cambay no se ve afectado durante un periodo de al menos tres días. Se observa que sólo los disolventes no polares fueron capaces de disolver el ámbar.

Como se ha mencionado anteriormente, el ámbar de Cambay es generalmente oscuro, muy frágil, y puede romperse fácilmente durante la preparación. Por lo tanto, en algunos casos, puede ser imposible examinar inclusiones de artrópodos adecuadamente para los propósitos sistemáticos. En tales casos, la disolución de la matriz de color ámbar es un método de investigación alternativa viable. Se permite la extracción de la totalidad de las inclusiones para diversos análisis, aunque el material es por lo general extremadamente frágiles después de la extracción. Los artrópodos aislados, así como otras inclusiones orgánicas, se pueden examinar con el microscopio de barrido electrónico para observar la conservación ultra estructural tal fina y delicada (figuras 1-3), lo que permite la resolución submicrónica de detalles morfológicos. Para preparar las muestras para el microscopio de barrido electrónico, se enjuagan con alcohol y se colocan en los soportes para que se sequen un poco y durante poco tiempo. Después de secar las muestras, estas fueron espolvoreadas y recubiertas con una fina capa de oro para su exanimación con el microscopio de barrido electrónico. La  excelente conservación de las cutículas de los artrópodos permitió el análisis histológico de las partes principales o e incluso de los organismos completos  lo que permitió un exámenes detallado así como la aplicación de métodos moleculares histoquímicos y otros (JR, NM, y Anke Schmitz material no publicado).

Por último, hay que destacar que las inclusiones raras o científicamente importantes no deben ser candidatas para la extracción ya que existe un peligro de desfragmentación de las mismas así como de una mínima alteración de su composición química. Estos ejemplares deben ser examinados de todas las maneras posibles dentro del ámbar para evitar su deterioro.

Referencias

Anderson, K., Winans, R., and Botto, R. 1992. The nature and fate of natural resins in the geosphere—II. Identification, classification and nomenclature of resinites. Organic Geochemistry 18: 829–841.CrossRef

Azar, D. 1997. A new method for extracting plant and insect fossils from Lebanese amber. Palaeontology 40: 1027–1029

Dutta, S., Mallick, M., Bertram, N., Greenwood, P.F., and Mathews, R.P. 2009. Terpenoid composition and class of Tertiary resins from India. International Journal of Coal Geology 80: 44–50. CrossRef

Galippe, V. 1920. Recherches sur la résistance des microzymas à l'action du temps et sur leur survivance dans l'ambre. Comptes Rendus de l´Académie des Sciences (Paris) 170: 856–858.

Fabri, R., Graeser, U., and Simo, T.A. 1996. Toluene. In: W. Gerhartz and Y.S. Yamamoto (eds.), Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th rev. ed., A27, 147–157. VCH Publishers, Weinheim.

Mallick, M., Dutta, S., Greenwood, P.F., and Bertram, N. 2009.Pyrolytic and spectroscopic studies of Eocene resin from Vastan lignite Mine, Cambay basin, Western India. Journal of the Geological Society of India 74: 16–22. CrossRef

Maury-Lechon, G. and Curtet, L. 1998. Biogeography and evolutionary systematics of the Dipterocarpaceae. In: S. Appanah and J.M. Turnbull (eds.), A Review of Dipterocarps: Taxonomy, Ecology and Sylviculture, 5–44. CIFOR, Bogor.

Poinar, G.O., Jr. 1992. Life in Amber. 350 pp. Stanford University Press, Stanford.

Ragazzi, E., Roghi, G., Giaretta, A., and Gianolla, P. 2003.Classification of amber based on thermal analysis. Thermochimica Acta 404: 43–54. CrossRef

Rust, J., Singh, H., Rana, R.S., McCann, T., Singh, L., Anderson, K., Sarkar, N., Nascimbene, P.F., Gerdes, F., Thomas, J.C., Solórzano-Kraemer, M.M., Williams, C.J., Engel, M.S., Sahni, A., and Grimaldi, D.2010. Biogeographic and evolutionary implications of a diverse paleobiota in amber from the Early Eocene of India. Proceedings of the National Academy of Science 107: 18360–18365. CrossRef

Soffritti, M., Belpoggi, F., Padovani, M., Lauriola, M., Esposti, D.D., and Minardi, F. 2004. Life-time carcinogenicity bioassays of toluene given by stomach tube to Sprague-Dawley rats. Survival 9: 91–102.

Tschirch, A. and Glimmann, G. 1896. Untersuchungen über die Sekrete. 21. Über das Dammarharz. Archiv der Pharmazie 234:585–589. CrossRef

van Aarssen, B.G.K., Cox, H.C., Hoogendoorn, P., and de Leeuw, J.W.1990. A cadinene polymer in fossil and extant dammar resins as a source for cadinanes and bicadinanes in crude oils from South east Asia. Geochimica et Cosmochimica Acta 54: 3021–3031. CrossRef

Viehmeyer, H. 1913. Ameisen aus dem Kopal von Celebes. Stettiner Entomologische Zeitung 74: 141–155.

Enlace del articulo comentado :

http://www.bioone.org/doi/full/10.4202/app.2012.0018