Los colores del pasado.

Introducción:

Los colores de los animales pueden ser ricamente informativos sobre aspectos del comportamiento, tales como ecología de forrajeo y su compañero de preferencia. Las aves, en particular, posean muchos matices sorprendentes y complejos patrones de pigmentación. Por analogía con las aves modernas, los comportamientos y los hábitats de las aves antiguas y otros dinosaurios emplumados podrán inferirse de pigmentos en plumas fósiles.

Fig. 1: Plumas fosilizadas en ámbar (Thomas et al, 2014).

A la izquierda, tres ejemplares de plumas fosilizadas en ámbar.

A la derecha, tres plumas de aves actuales correlacionadas.

Las aves modernas muestran seis clases químicamente distintas de pigmento de la pluma, de los cuales los carotenoides son los más comunes después de melaninas. Los carotenoides otorgan principalmente tonalidades de amarillo, naranja y rojo a los colores de plumas (Thomas et al, 2013; McGraw, 2006). De modo que los autores que desarrollaron el artículo <<Thomas, D.B., Nascimbene, P.C., Dove, C.J., Grimaldi, D.A. & James, H.F. 2014. Seeking carotenoid pigments in amber-preserved fossil feathers. Sci. Rep., 4, 5226.>> se centran en las plumas incluidas en ámbar (Fig. 1) porque la encapsulación dentro de ámbar puede aislar las moléculas de carotenoides contra la alteración diagenética, y tales pigmentos conservados podrían ser detectados mediante la espectroscopía de Raman.

Estudio de los carotenoides:

Los carotenoides tienen una señal espectral Raman inequívoca de que se ha mejorado en gran medida por un efecto de resonancia (Schulz et al, 2005). Además, la espectroscopía de Raman se puede realizar sin preparación o la destrucción de la muestra. Edwards et al. (2007) mostraron que las inclusiones en ámbar pueden ser estudiados con mínima o ninguna interferencia de la matriz de color ámbar cuando los espectros Raman se recogen con una óptica confocal y a 1064 nm de excitación.

Con microscopía Raman convencional, la luz láser se canaliza a través del objetivo de un microscopio hacia la muestra, y la luz dispersada a continuación, se canaliza a través del mismo objetivo hacia un detector. La luz penertra y se dispersa por todo el volumen de la muestra, y la mayor concentración de fotones dispersados ​​son mayoritariamente reflejados desde el plano focal de la luz incidente. En consecuencia, la luz es dispersada tanto de la superficie como el interior de una muestra translúcido.

La microscopía confocal Raman difiere de la microscopía Raman convencional mediante la inclusión de un agujero de alfiler confocal por encima del objetivo del microscopio. El agujero de alfiler permite que sólo los fotones dispersados ​​desde el plano focal puedan alcanzar el detector. Para una muestra translúcida con una inclusión, se puede la puede ser posicionar en el plano focal de la luz incidente y sólo la luz dispersada por dicha inclusión alcanzará el detector. Por lo tanto, la microscopía Raman confocal proporciona útilmente información química sobre una inclusión con mínima o ninguna interferencia de la superficie o de la matriz circundante.

La espectroscopía Raman suele menos sensible en el estudio de los pigmentos cerca de las longitudes de onda de excitación de los infrarrojos que con respecto a las longitudes de onda visibles. Sin embargo, las longitudes de onda de excitación visibles tienden a inducir fluorescencia al interactuar con ámbar (Edwards et al, 2007). Así que, desde una perspectiva de señal frente a ruido, el espectro Raman de una inclusión en ámbar recogido con una longitud de onda cercana al infrarrojo puede ser sustancialmente más informativo que un espectro Raman de la misma inclusión recogido con una longitud de onda visible. Un microscopio Raman confocal con un infrarrojo (NIR) láser cerca es, pues, una herramienta ideal para la búsqueda de carotenoides conservados en ámbar.

Métodos:

Primero se realizó un estudio piloto para determinar si los pigmentos carotenoides de una pluma moderna podrían ser detectados a través de una matriz de color ámbar. Una pluma de ala amarilla y negra de un verderón, Carduelis chloris, se colocó debajo de una pieza pulida de color ámbar y se analizó con la espectroscopía Raman.

En una segunda serie de experimentos, se analizaron seis plumas fósiles conservados en ámbar utilizando espectroscopía Raman y microscopía de luz. La evidencia de la pigmentación en las plumas fósiles se buscó con la espectroscopía Raman, y la preservación de la morfología a escala fina se estudió con microscopía de luz.

Por último, se recogieron los espectros Raman y las imágenes de microscopía electrónica de barrido de una antigua pluma preservada como fósil de compresión carbonizado. Dichos fósiles han proporcionado previamente evidencias de la pigmentación de melanina (Li et al, 2010; Wogelius et al, 2011).

Resultados:

Espectroscopía Raman.

Fig. 2: Pigmentos carotenoides de plumas
detectables a través de una matriz de color ámbar
con la espectroscopía Raman.

Los espectros Raman de las barbas amarillas de un verderón europeo (Fig. 2), Carduelis chloris (pájaro moderno) determinan que la pluma poseía una serie de bandas distintivas de carotenoides en 1530 y 1153 cm⁻¹ (Thomas et al, 2013; Schulz et al, 2005; Hsu et al, 1976; Veronelli et al, 1995). También destaca una tercera banda prominente en 1001 cm⁻¹ equivalente tanto con el pigmento de carotenoide y como con la queratina de las plumas, existen otras bandas en 1444 cm⁻¹ y 1657 cm⁻¹ relacionadas con la queratina.

El espectro de las barbas negras del mismo plumaje de verderón europea tenía una sola banda a 1078 cm⁻¹ como la única característica discernible; y no se han las asignaciones dicha medida de banda en las fuentes bibliográficas. La banda de 1078 cm⁻¹ fue evidente al lado de las bandas de 1530 cm⁻¹, 1153 cm⁻¹ y 1001 cm⁻¹ en la lengüeta de color amarillo-negro de la pluma de verderón europea y, por contra, no se observó en los espectros recogidos de las púas de plumas amarillas o en alguno de los tres estándares del instrumento (acetaminofeno, calcita, ciclohexano). Los espectro de las barbas de plumas negro y amarillo-negro se recogieron en potencias bajas de láser y, por consiguiente tenían altos niveles de ruido espectral, que manifiestan como artefactos espectrales tras la corrección de la línea de base y de alisado espectral (Fig. 2).

Cinco plumas fósiles conservados en ámbar fueron incrustadas en una resina epoxi. La resina epoxi tenía un espectro Raman con bandas distinta en 1110, 1181, 1220, 1289, 1450 y 1610 cm⁻¹ (Fig. 3). Espectros Raman de las matrices de ámbar tenía bandas en 1193, 1436, 1452 y 1647 cm⁻¹. Teniendo en cuenta que las bandas de Raman en la identificación de carotenoides no se observaron en los espectros obtenidos para matrices de color ámbar, todos los espectros de todos los análisis de las plumas en ámbar contenía la banda 1,078 cm⁻¹, y muchos espectros contenía bandas espectrales de ámbar (Fig. 3). El 1078 cm⁻¹ banda era también la única característica en el espectro de la pluma fósil de la Formación Río Verde, y en los espectros de la matriz sedimentaria de dicha Formación. No se recuperaron evidencia de la pigmentación de los carotenoides con la espectroscopía Raman para las plumas fósiles.

Fig. 3: espectros Raman de una pluma fósil conservada en ámbar
y de un fósil de compresión carbonizado.

Microscopía

La microestructura de la pluma se conservó con alta fidelidad en cada una de las plumas fósiles en ámbar (Fig. 1). No se observaron evidencias morfológicas de la taxonomía a nivel de orden de las plumas fósiles, a pesar de que las características morfológicas de tres plumas preservadas en ámbar eran análogas a las microestructuras en las plumas modernas.

Las barbas filamentosas de Bu-JZC-F2a eran morfológicamente similares a las púas plumulaceous de una pluma de contorno de un buitre negro, Coragyps atratus (Fig. 1). Las plumas de las barbas en Bu-JZC-F9 eran morfológicamente similares a las púas sub-pennaceous de un Tringa semipalmata actual; en Bu-JZC-F9 los cuerpos oscuros separados a lo largo bárbulas son similares a las estructuras de pigmento en una pluma de Tringa semipalmata. Las barbas oscuras de AMNH-DR-1432 conservan ganchitos pennaceous, y eran morfológicamente similares a las púas de ricas en melanina de un cuervo americano (Corvus brachyrhynchos).

Fig. 4: Traza la evidencia de la pigmentación de la melanina
en una pluma fósil del Eoceno.

Una pluma fósil de compresión de la Formación del Río Verde fue fotografiada con un microscopio electrónico de barrido (Fig. 4). La pluma fósil presentaba una superficie fracturada, y los bordes de la fractura y los valles contenían estructuras alargadas con longitudes del eje largo de unas 2-3 μm (Fig. 4).

Discusión:

La espectroscopía Raman es una técnica viable para la búsqueda de pigmentos carotenoides en ámbar sin la destrucción de la muestra.

El análisis de la pluma de verderón actual mostró que la evidencia clara de carotenoides podría ser recogida a través de una matriz de color ámbar. Estudiamos púas amarillas, amarillo-negruzcas y negras en la pluma de verderón; atendiendo a los estudios previos de McNamara et al (2013) que demostraban la pigmentación negra del plumaje con la melanina. Espectros Raman de las púas amarillo-negruzcas contenía bandas informativas de carotenoides, lo que indica que la melanina co-depositada no oscurece la evidencia espectral Raman para los carotenoides. Empleando las observaciones de barbas de plumas actuales como referencia, se buscó evidencias de carotenoides en las plumas fósiles con espectroscopía Raman. Las distintas bandas espectrales Raman atribuidas a pigmentos carotenoides no se observaron en los espectros de las plumas fósiles en ámbar.

Segun Thomas et al (2014) la espectroscopia Raman puede detectar concentraciones muy bajas de carotenoides presentes en las plumas y, por lo tanto, ante la ausencia de bandas espectrales de carotenoides resulta improbable que se trate de una cuestión de la sensibilidad del instrumento, sino que puede indicar una ausencia original de los pigmentos carotenoides o el pérdida diagenética de los mismos (Briggs, 1999)

En el presente estudio, no se recuperó información química sobre la queratina de las plumas, aunque se observaron a escala micrométrica estructuras finamente detalladas de pennaceous y plumulaceous conservadas dentro del ámbar. Para explicar la ausencia de los carotenoides, la degradación de los mismo debe haber ocurrido en ausencia de alteración física a escala mircrométrica por alteración diagenética. Alternativamente, los pigmentos pueden haber estado originalmente ausentes de las plumas que hemos estudiado. En base a las observaciones realizadas de las aves contemporáneas, los pigmentos carotenoides parecen ser más comunes en las plumas pennaceous que en plumas plumulaceous, y los pigmentos de melanina son sustancialmente más comunes en ambos tipos de plumas, en comparación con pigmentos carotenoides (datos no publicados). Por lo tanto, la probabilidad de encontrar una pluma fósil preservada en ámbar pigmentada con carotenoides es sustancialmente menor que la probabilidad de encontrar el fósil de una pluma pigmentada de melanina.

Los Espectros Raman de las púas de verderón pigmentadas de melanina eran idénticos a los espectros Raman de las plumas en ámbar. Además, las plumas en ámbar parecen preservar las mismas microestructuras de pigmento que se observan en los colores de la melanina de las plumas modernas (Fig. 1). Por desgracia, la evidencia espectral Raman no proporciona un diagnóstico inequívoco de la pigmentación de la melanina. Mientras que un espectro "de tipo melanina" se recogió de un fósil de compresión con la evidencia SEM para la melanina, un espectro de sedimentos casi idéntico se recogió de los alrededores Formación Río Verde. La banda espectral Raman de 1078 cm⁻¹ que se midió en cada uno de estos sustratos no ha sido previamente reportada para una estructura de melanina pigmentada, y por lo tanto somos prudentes al interpretar la característica espectral como una señal analítica. El 1078 cm⁻¹ es probablemente un efecto causad por fluorescencia de la muestra. En resumen, nuestro análisis Raman proporcionan una fuerte evidencia de la ausencia de pigmentos carotenoides en las plumas de color ámbar-conservado, y una señal química equívoca de la pigmentación de la melanina.

Conclusión:

En definitiva, la espectroscopia Raman es un buen complemento para las herramientas que actualmente se utilizan para describir los pigmentos en las plumas antiguas bien conservadas. La microscopía electrónica de barrido y de fluorescencia de rayos X proporcionan evidencia de la pigmentación de la melanina en los fósiles de compresión, y la espectroscopia Raman podría proporcionar evidencia de la pigmentación de carotenoides en las plumas de color ámbar-preservado. Raman también podría ser útil para la identificación de otros pigmentos de plumas preservadas en ámbar (Thomas et al, 2013), y para el estudio de otras inclusiones que pueden ser pigmentadas (Poinar, 2002). Aunque no encontramos carotenoides en las plumas que hemos estudiado, hemos demostrado que la espectroscopia NIR Raman confocal es un método informativo y no destructivo para la topografía de la composición química de las plumas fósiles.

Referencias:

• Briggs, D.E.G. 1999. Molecular taphonomy of animal and plant cuticles: selective preservation and diagenesis. Phil. Trans. Roy. Soc. B., 354: 7 - 16 pp.

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• Hsu, S.L. , Moore, W.H. & Krimm, S. 1976. Vibrational spectrum of unordered polypeptide chain - Raman study of feather keratin. Biopolymers, 15: 1513–1528 pp. 

• Li, Q. et al. 2010. Plumage color patterns of an extinct dinosaur. Science, 1369: 1369–1372 pp.

• McGraw, K.J. 2006. In Bird Coloration volume 1. Mechanisms and Measurements. Eds Hill, G.E. y McGraw, K.J. Harvard University Press: 177 - 242 pp.

• McNamara, M.E. , Briggs, D.E.G. , Orr, P.J. , Campo, D.J. & Wang, Z. 2013. Experimental maturation of feathers: implications for reconstructions of fossil feather colour. Biol. Lett. 9.

• Poinar, G., Jr. 2002. Fossil palm flowers in Dominican and Baltic amber. Botan. J. Linn. Soc., 139: 361–367 pp.

• Schulz, H. , Baranska, M. & Baranski, R. 2005. Potential of NIR-FT-Raman spectroscopy in natural carotenoid analysis. Biopolymers, 77: 212 - 221 pp.

• Thomas, D.B. , McGoverin, C.M. , McGraw, K.J. , James, H.F. & Madden, O. 2013. Vibrational spectroscopic analyses of unique yellow feather pigments (spheniscins) in penguins. J. Roy. Soc., 10.

• Thomas, D.B. , McGraw, K.J. , James, H.F. & Madden, O. 2014. Non-destructive descriptions of carotenoids in feathers using Raman Spectroscopy. Anal. Methods, 6: 1301–1308 pp.

• Veronelli, M., Zerbi, G. & Stradi, R. 1995. In situ resonance Raman spectra of carotenoids in bird's feathers. J. Raman Spectrosc, 26: 683–692 pp.

• Wogelius, R. A. et al. 2011. Trace Metals as Biomarkers for Eumelanin Pigment in the Fossil Record. Science, 333: 1622–1626 pp.