Análisis del estado de preservación de un fósil de ave coliforme del Eoceno: diferenciación bioquímica y geoquímica.

Fotografía 1: Pareja de aves coliformes actuales.

Antes de comenzar es necesario recomendar a los lectores echar un vistazo a la entrada de nuestro compañero Rubén, titulada ‘’Los colores del pasado’’, ya que otorga información relevante con esta entrada sobre técnicas de análisis aplicadas a restos fósiles de aves, concretamente al plumaje. Otra entrada altamente recomendable y bastante reciente es la de nuestro compañero Daniel, titulada ‘’El Vesubio: Una puerta a las extinciones del Cretácico’’, ya que aporta información importante sobre la biota de Jehol (China), de la cual se hablará en esta entrada. Para todos aquellos que deseen profundizar en temas relacionados con las aves les invito a leer cualquiera de mis anteriores entradas (Archaeopteryx, ¿el verdadero origen de las aves?, El registro fósil aviar en el Sudeste Asiático Insular y sus implicaciones para la biogeografía y paleoecología aviar, El rendimiento aerodinámico del ave voladora más grande de todos los tiempos y Los verdaderos reyes del cielo).

Preámbulo

Las aves coliformes son una familia de aves, la única del orden Coliiformes, cuyos miembros son denominados comúnmente pájaros ratón (mousebirds). Son un grupo muy reducido sin afinidades cercanas con otros grupos. En la actualidad es el único orden de aves restringido exclusivamente al continente africano, aunque en el pasado tenían una distribución más amplia. De hecho, aparentemente evolucionaron en Europa.

Son aves de tono grisáceo o castaño con un plumaje muy suave, el cuerpo delgado y la cola delgada y alargada. Presentan garras fuertes y dedos exteriores reversibles. El nombre de pájaros ratón (mousebirds) se debe a que se mueven entre las hojas como los roedores en busca de bayas, fruta y brotes.

Los pájaros ratón pueden considerarse fósiles vivientes, pues las seis especies que quedan actualmente son las supervivientes de un linaje mucho más diverso de finales del Paleógeno y el Mioceno.

Fotografía 2: El nombre de pájaros ratón se debe a su parecido con los roedores en el movimiento entre la maleza a la hora de buscar alimento (bayas, fruta y brotes).

Una vez introducido un breve preámbulo, debemos destacar que el contenido de esta entrada se basa principalmente en el siguiente artículo científico:

• Egerton, V.M., Wogelius, R.A., Norell M.A., Edwards, N.P., Sellers, W.I., Bergmann, U., Sokaras, D., Alonso-Mori, R., Ignatyev, K., van Veelen, A., Anné, J., van Dongen, B., Knolla, F. &  Manninga, P.L. 2015. The mapping and differentiation of biological and environmental elemental signatures in the fossil remains of a 50 million year old bird. J. Anal. At. Spectrom., 30: 627-634.

Introducción

Los fósiles se forman debido a una serie de cambios físicos y químicos que se suceden una vez que el organismo perece. La tafonomía se encarga de estudiar estos cambios y sus interacciones sobre los restos enterrados. 

Los restos esqueléticos mineralizados como conchas, dientes y huesos se preservan con mayor facilidad debido a su estructura cristalina (Behrensmeyer et al., 2000) mientras que la conservación de tejidos blandos es extremadamente remota y queda restringida a lugares con unas condiciones muy particulares. Dentro de los ambientes terrestres, pueden producirse casos de conservación excepcional en ambientes lacustres dada la baja energía del medio y las condiciones de anoxia como muestran los trabajos de Behrensmeyer (1991) y Behrensmeyer et al. (2000).

Así fue en su momento la Formación Green River (EEUU), la cual actualmente consta de unos depósitos de caliza del Eoceno que se formaron por una sobresaturación de carbonato cálcico en un ambiente lacustre. Una gran diversidad de animales quedó preservada en esta sucesión de carbonatos.

En este trabajo se discute el excelente estado de conservación del fósil de un ave coliforme del Eoceno de la Formación Green River y la complejidad en su preservación tanto a nivel endógeno (bioquímico) como exógeno (geoquímico).

Métodos

Los restos fosilizados de un ave coliforme (AMNH FARB 30806) fueron examinados de las colecciones del Museo Americano de Historia Natural (Nueva York, EEUU). Este espécimen fue recogido del lago fósil de la Formación Green River (≈50 Ma). Un pequeño fragmento de la punta distal del ala izquierda fue retirado de la muestra, ya que presentaba una pequeña fractura, y se empleó para ser escaneado en el microscopio electrónico de barrido.

A la muestra se le aplicaron técnicas de fluorescencia de rayos X por sincrotrón y una espectroscopia de absorción de rayos X. En el trabajo de Bergmann et al. (2012) se explica profundamente el funcionamiento de estas dos técnicas aplicadas en el estudio de la muestra. A continuación, se describen todas las técnicas aplicadas sobre la muestra:

El escaneo de la fluorescencia de rayos X por sincrotrón (SRS-XRF) permite que ejemplares completos puedan ser analizados y mapeados químicamente. La principal ventaja de esta técnica es que no es destructiva, ya que no precisa de la extracción de ninguna parte concreta del fósil sino que realiza un escaneo de la muestra completa, lo que permite analizar fósiles con una matriz geológica incrustada. Esta técnica permite visualizar una distribución de elementos concretos asociados a procesos biológicos o geológicos. Se empleó un detector de silicio para detectar las emisiones de rayos X de hasta 16 elementos simultáneamente. Los elementos mapeados en la muestra fueron los siguientes: silicio, fósforo, azufre, cloro, potasio, calcio, titanio, manganeso, hierro, níquel, cobre, zinc, arsénico, bromo, bario y mercurio. Para finalizar con esta técnica se empleó el programa computerizado ImageJ (Schneider et al., 2012) con el plugin Image CorrelationJ (Chinga & Syverud, 2007) para realizar una correlación espacial de la distribución de los elementos presentes en la muestra.

La cuantificación y espectroscopia de la absorción de rayos X próxima al borde (XANES) de S y Cu, tratada por Rehr & Albers (2000), se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que el SRS-XRF con la consiguiente obtención de un espectro que mostró los datos que se recogieron durante 100 segundos en cada uno de los puntos (Fotografía 3). Los análisis de cada uno de los puntos fueron ajustados utilizando el software libre PyMCA (Solé et al., 2007) y calibrados frente a un mineral estándar de referencia (apatito de Durango). Esta espectroscopia se realizó para determinar los estados de oxidación de ciertos elementos.

Otra técnica que se le aplicó a la muestra fue la espectroscopia de absorción de rayos X extendida de estructura fina (EXAFS). Esta espectroscopia se llevó a cabo para averiguar la coordinación química del Mn.

También se le aplicó a la muestra la llamada microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM) con espectroscopia de energía dispersiva (ESEM-EDS). En esta técnica la muestra fue fotografiada en un vacío parcial utilizando unos detectores de retrodispersión de electrones y de electrones secundarios.

Fotografía 3: (A) Fósil de ave coliforme (AMNH FARB 30806) de la Formación Green River. Los números se corresponden con la localización exacta de los elementos de número atómico elevado (1-7) y de número atómico bajo (8-12). Escala = 5 cm (B) Vista ampliada del recuadro de la parte superior de A, que contiene la pluma que posteriormente fue retirada para su estudio con el microscopio electrónico de barrido. Escala = 2 cm. (C) Vista ampliada del recuadro de la parte inferior de A, que muestra el gran estado de conservación de las plumas. Escala = 2 cm.

Resultados

La preservación de las plumas en AMNH FARB 30806 es variable, ya que presenta unas plumas bien conservadas (Fotografía 3C) y otras que están más descompuestas (Fotografía 3A).

El mapeado por SRS-XRF revela que algunos elementos están asociados a estructuras biológicas y otros siguen una distribución de acuerdo a ciertos procesos geológicos. El P, S, Ca, Cu y Zn se sitúan entre los huesos, las plumas y las cuencas oculares. El Cu se distribuye a lo largo de las plumas con mayor intensidad en la parte proximal. El P se encuentra restringido a los huesos (como era de esperar), pero también tiene una gran presencia en la matriz que sepulta parte del fósil. El Ba, Ni, Mn, Cl y en menor medida el Br también están asociados a las plumas de este ejemplar. La cuantificación corrobora el mapeado y muestra que el P, S, Cl, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn y Br se encuentran en mayor medida en las plumas en comparación con la matriz. Además, el Mn, Ni, Cu, Zn, y Br se encuentran en mayor medida en las cuencas oculares que en la matriz. Finalmente, el P, S, Mn, Ni y Zn muestran mayor presencia en los huesos que en la matriz.

La espectroscopia XANES revela la presencia de 4 estados de oxidación para el S. Las formas más reducidas del azufre aparecen exclusivamente en las plumas bien conservadas y no están presentes en la matriz. Esta espectroscopia sugiere que el Cu se encuentra presente como un quelato organometálico (Wogelius et al., 2011 y Manning et al., 2013) más que un compuesto inorgánico como los óxidos de Cu.

La espectroscopia EXAFS indica que el Mn entre las plumas se encuentra contenido en un precipitado químico (óxidos). El entorno de coordinación local del Mn es extrapolable a estar contenido en birnesita. El Mn situado entre las plumas es inorgánico, y seguramente procede de la precipitación geoquímica post-mortem.

Fotografía 4: Mapas de elementos por espectroscopia SRS-XRF aplicada sobre AMNH FARB 30806. En A el color rojo corresponde al cobre, en B el verde al zinc, en C el azul al fósforo y el amarillo al azufre. En A y B se aprecia como el cobre y zinc se encuentran claramente distribuidos entre las plumas. En A el recuadro superior se corresponde con B de la fotografía 3 y el inferior con C de la fotografía 3. En A la flecha inferior señala el raquis de una pluma. En C se observa como el fósforo tiene una marcada presencia en los huesos mientras que el azufre la tiene en las plumas. Las flechas superiores en A, B y C señalan la cuenca ocular. Escala = 5 cm.

La microscopía ESEM revela una película predominantemente carbonosa con precipitados cristalinos a lo largo de las plumas. También se han encontrado estructuras ovoides (posibles eumelanosomas).

Además, el espectro de la microscopía ESEM ha revelado una mayor cantidad de C, S, Mg y Ti en las plumas que en la matriz. Además, ha revelado una abundante cantidad de Ca en la matriz para tratarse de una roca carbonática.

Discusión

Los análisis del SRS-XRF muestran que hay una combinación química tanto a nivel endógeno como a nivel exógeno en AMNH FARB 30806. Revelan que el S, P, Cu y Zn se localizan en estructuras biológicas (plumas y huesos) por lo que estos elementos tienen un origen orgánico. La espectroscopia XANES muestra que el S se localiza abundantemente entre las plumas y sus formas reducidas se encuentran en cantidades ínfimas en la matriz, corroborando que el S tuvo un origen orgánico.

El Cu está presente como un quelato asociado a la pigmentación (melanina) y por lo tanto, también presenta un origen orgánico. De hecho, la abundancia y variabilidad de cobre entre las plumas sugieren una pigmentación oscura durante la vida del organismo (Wogelius et al., 2011, Hill & McGraw, 2006 y Niecke et al., 1999), pero teniendo en cuenta la variación del estado de preservación de unas plumas a otras es muy complicado trazar asociaciones con la intensidad de Cu orgánico entre las plumas.

El P está limitado a los huesos, pero está presente en unas cantidades ligeramente menores (≈10% en peso) de las esperadas en aves actuales (≈11-20% en peso) como muestra el trabajo de Goodwin et al. (2007). Aun así es suficiente para afirmar que el P es de origen orgánico pues en la matriz presenta unas cantidades ínfimas (≈0,1% en peso). Como han demostrado estudios anteriores (Bergmann et al., 2010 y Goodwin et al., 2007), la pérdida de P en los huesos se produce en determinados ambientes y probablemente sea el caso de AMNH FARB 30806.

Como hemos comentado anteriormente, la preservación de las plumas en AMNH FARB 30806 es variable, ya que presenta unas plumas bien conservadas y otras más descompuestas. La fotografía 3C muestra una de las plumas bien conservadas con una preservación gradacional lo que demuestra variaciones laterales de preservación a una escala milimétrica. 

El Cu y Zn además de concentrarse en las plumas también se concentran en la órbita ocular (Fotografía 4A y 4B). Las concentraciones de estos elementos son elevadas comparadas con las de la matriz y semejantes a las presentes en las plumas. Estas concentraciones elevadas de Cu y Zn en las plumas y en las cuencas oculares probablemente se deben a la pigmentación original del animal en dichas partes corporales (Jones et al., 2007). Muchos fósiles de dinosaurios aviares y no aviares de la biota de Jehol (noreste de China) muestran grandes cantidades de pigmento en las cuencas oculares (Chen et al, 2008). La presencia de los melanosomas en las partes pigmentadas del ojo se atribuye a una función de protección frente a la exposición prolongada del ojo tanto a la luz visible como a la ultravioleta así como de protección frente a los radicales libres de oxígeno (Jones et al., 2007, Kiama et al., 1994 y Hu et al., 2008).

Inicialmente, la distribución de Mn en AMNH FARB 30806 parece seguir estructuras biológicas al igual que el Cu y S. Podría interpretarse que el Mn deriva de la melanina. Sin embargo, la espectroscopia EXAFS revela que el Mn está presente como un óxido inorgánico. En este caso, lo más probable es que los fluidos reductores fluyeran a través de la capa más permeable que contenía al fósil y se oxidaran debido a la presencia de altos niveles de oxígeno. El Mn(II) soluble se oxidaría a Mn(IV) insoluble, provocando que los óxidos de manganeso se nuclearan sobre el material fósil. Esto demuestra la importancia que tiene la espectroscopia EXAFS dado que nos permite diferenciar precipitados inorgánicos de material derivado biológicamente.

El Ba es indicativo de precipitados inorgánicos y su correlación con el Mn y Ni parece indicar que estos dos elementos también son de origen inorgánico e incluso que formaron parte de la misma fase. La localización del Ba, Ni y Mn a lo largo de los huesos y el raquis de las plumas sugieren que estas estructuras biológicas entraron en contacto con un fluido diagenético. Esto, a su vez, favoreció la precipitación de estos elementos, además de otros como el Br y el Cl.  

La mayoría de las plumas examinadas muestran una película carbonosa desecada con minerales de origen diagénetico. En AMNH FARB 30806 hay pocas pruebas de la presencia de posibles eumelanosomas (orgánulos alargados asociados a la pigmentación oscura) y ninguna de fiomelanosomas (orgánulos circulares asociados a la pigmentación clara) (Fotografía 5B y 5C). Los posibles eumelanosomas aparecen como moldes externos, pero debido a la degradación de las plumas es difícil determinar si estas estructuras se produjeron en el sedimento (bacterias) o en las plumas (eumelanosomas), y, por lo tanto, determinar si son eumelanosomas o bacterias, ya que la única manera de diferenciarlos es la localización (Moyer et al., 2014).

Fotografía 5: ESEM de las plumas de AMNH FARB 30806. (A) Imagen de electrones secundarios de una película carbonosa, minerales y posibles eumelanosomas. Escala = 50 µm. (B) Imagen de retrodispersión de electrones de una posible preservación de eumelanosomas. Escala = 10 µm. (C) Imagen de electrones secundarios de una posible preservación de eumelanosomas. Escala = 5 µm.

Conclusión

La conservación de tejidos blandos en los fósiles es el resultado de la interacción entre los procesos bioquímicos y geoquímicos que tienen lugar una vez que muere el organismo.

Aunque el fósil de ave analizado (AMNH FARB 30806) presenta una buena conservación no se le puede considerar necesariamente excepcional. Sin embargo, aporta una valiosa información sobre la tafonomía de aves de la Formación Green River.

Este estudio ha sido capaz de diferenciar claramente los restos orgánicos de aquellos restos que han sido sobreimpresos por precipitados geoquímicos. Por ejemplo, en las plumas se realizó un análisis químico en el que se halló S y Cu, cuya presencia ligada indica un origen orgánico procedente de la queratina y melanina, respectivamente. Además, se describió la presencia de elementos exógenos (Ba, Br y Ni) a lo largo de los huesos y las plumas, con los restos orgánicos actuando como sitios de nucleación para precipitados geoquímicos.

Finalmente, deben llevarse a cabo análisis exhaustivos para revelar con precisión la historia tafonómica de los fósiles, utilizando la cuantificación y distribución química para conocer más detalladamente la biología y bioquímica del pasado.

Para profundizar

• La Formación Green River (Web).      
• Entrevistas en la Formación Green River  sobre la historia de este ambiente lacustre en el pasado, procesos de fosilización y mucho más. Altamente recomendable, ya que muestra fósiles en el yacimiento de la misma Formación Green River. La aventura de pasar de encontrarte un fósil de tortuga a encontrarte un coprolito (Vídeo).

Referencias bibliográficas

- Artículos publicados en revistas científicas

• Behrensmeyer, A.K., Kidwell, S.M. & Gastaldo, R.A. 2000. Taphonomy and paleobiology. Paleobiology, 26: 103–147.
• Bergmann, U., Manning, P.L. & Wogelius, R.A. 2012. Chemical Mapping of Paleontological and Archeological Artifacts with Synchrotron X-Rays. Annu. Rev. Anal. Chem., 5: 361-389.
• Bergmann, U., Morton, R.W., Manning, P.L., Sellers, W.I., Farrar, S., Huntley, K.G., Wogelius, R.A. & Larson, P. 2010. Archaeopteryx feathers and bone chemistry fully revealed via synchrotron imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107: 9060–9065.        
• Chinga, G. & Syverud, K. 2007. Quantification of paper mass distributions within local picking areas. Nord. Pulp Pap. Res. J., 22: 441-446.
• Egerton, V.M., Wogelius, R.A., Norell M.A., Edwards, N.P., Sellers, W.I., Bergmann, U., Sokaras, D., Alonso-Mori, R., Ignatyev, K., van Veelen, A., Anné, J., van Dongen, B., Knolla, F. &  Manninga, P.L. 2015. The mapping and differentiation of biological and environmental elemental signatures in the fossil remains of a 50 million year old bird. J. Anal. At. Spectrom., 30: 627-634.
• Goodwin, M.B., Grant, P.G., Bench, G. & Holroyd, P.A. 2007. Elemental composition and diagenetic alteration of dinosaur bone: Distinguishing micron-scale spatial and compositional heterogeneity using PIXE. Palaeogeogr., Palaeoclimatol., Palaeoecol., 253: 458-476.
• Hu, D.-N., Simon, J.D. & Sarna, T. 2008. Role of Ocular Melanin in Ophthalmic Physiology and Pathology. Photochemistry and Photobiology., 84: 639–644.
• Jones, M.P., Pierce Jr, K.E. & Ward, D. 2007. Avian Vision: A Review of Form and Function with Special Consideration to Birds of Prey. J. Exot. Pet Med., 16: 69–87.
• Kiama, S.G., Bhattacharjee, J. & Weyrauch, K.D. 1994. A scanning electron microscope study of the pecten oculi of the black kite (Milvus migrans): possible involvement of melanosomes in protecting the pecten against damage by ultraviolet light. J. Anat., 185: 637–642.
• Manning, P., Edwards, N.P., Wogelius, R.A., Bergmann, U., Barden, H.E., Larson, P., Schwarz-Wings, D., Egerton, V.M. & Sellers, W.I. 2013. Synchrotron-based chemical imaging reveals plumage patterns in a 150 million year old early bird. J. Anal. At. Spectrom., 28: 1024-1030.      
•  Moyer, A.E., Zheng, W., Johnson, E.A., Lamanna, M.C., Li, D.-q., Lacovara, K.J. & Schweitzer, M.H. 2014. Melanosomes or microbes: testing an alternative hypothesis for the origin of microbodies in fossil feathers. Sci. Rep., 4: 4233.
• Niecke, M., Heid, M. & Krüger, A. 1999. Correlations between melanin pigmentation and element concentration in feathers of White-tailed Eagles (Haliaeetus albicilla). J. Ornithol., 140: 355-362.
• Rehr, J.J. & Albers, R.C. 2000. Theoretical approaches to x-ray absorption fine structure. Rev. Mod. Phys., 72: 621-654.
• Schneider, C.A., Rasband, W.S., & Eliceiri, K.W. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods, 9: 671-675.
• Solé, V.A., Papillon, E., Cotte, M., Walter, P. & Susini, J. 2007. A multiplatform code for the analysis of energy-dispersive X-ray fluorescence spectra. Spectrochim.Acta Part B, 62: 63-68.
• Wogelius, R.A., Manning, P.L., Barden, H.E., Edwards, N.P., Webb, S.M., Sellers, W.I., Taylor, K.G., Larson, P.L., Dodson, P., You, H., Da-qing, L. & Bergmann, U. 2011. Trace metals as biomarkers for eumelanin pigment in the fossil record. Science, 333: 1622-1626.

- Capítulo de libro

• Behrensmeyer, A.K. 1991. Terrestrial Vertebrate Accumulations. En: Allison, P.A. & Briggs, D.E.G. (eds.), Taphonomy: Releasing the Data Locked in the Fossil Record, pp. 291-335. New York: Plenum.

- Libro

• Hill, G.E. & McGraw, K.J. 2006. Bird Coloration: Mechanisms and measurements, Harvard University Press, 581 pp.

- Libro colectivo

• Chen, P.-j., Wang, Y, Wang, Y.-q. & Chang, M.-M. (eds.). 2008. The Jehol Fossils: The Emergence of Feathered Dinosaurs, Beaked Birds and Flowering Plants. Academic Press, London, 208 pp.